• 【發(fā)布單位】衛(wèi)生部
• 【發(fā)布文號】--
• 【發(fā)布日期】2006-05-26
• 【生效日期】2006-05-26
• 【失效日期】--
• 【文件來源】衛(wèi)生部
• 【所屬類別】政策參考

人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及實驗室檢測技術(shù)方案

人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及實驗室檢測技術(shù)方案





 為及時、科學(xué)地采集和運送人禽流感病例或疑似污染環(huán)境等各種類型的標(biāo)本，規(guī)范實驗室檢測程序和檢測方法，提高檢測質(zhì)量，明確診斷或開展相關(guān)科學(xué)研究，特制定本方案。



 1 采集對象



 1.1 人禽流感醫(yī)學(xué)觀察病例、疑似病例、臨床診斷病例及需要進一步研究的確診病例。



 1.2 其它需要進行人禽流感診斷或排除者。



 1.3 需要采集的環(huán)境標(biāo)本。



 2 采集要求



 2.1 從事人禽流感檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實驗技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員參照（附件5）規(guī)定的防護措施進行安全防護。



 2.2 住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。



 2.3 標(biāo)本采集具體種類和數(shù)量由現(xiàn)場工作組確定。



 2.4 密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)負(fù)責(zé)采集。



 2.5 根據(jù)實驗室檢測工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。



 3 標(biāo)本種類



 每個病例應(yīng)盡可能同時采集上、下呼吸道標(biāo)本；需要排除人禽流



 感的死亡病例則依據(jù)《傳染病病人或疑似傳染病病人尸體解剖查驗規(guī)定》（中華人民共和國衛(wèi)生部令第43號）的規(guī)定采集尸體標(biāo)本，沒有條件進行尸體解剖的，可采集呼吸道灌洗液或經(jīng)皮穿刺采集肺組織標(biāo)本。



 3.1 上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。最佳采集時間為發(fā)病后3天內(nèi)。



 3.2 下呼吸道標(biāo)本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。



 3.3 尸檢標(biāo)本：病人死亡后應(yīng)依法盡早進行解剖，在嚴(yán)格按照生物安全防護的條件下，進行尸檢，主要采集肺、氣管組織標(biāo)本，條件允許下也可采集肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。



 3.4 血清標(biāo)本：每一病例必須采集血清標(biāo)本，須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周采集。采集量要求5ml，以空腹血為佳，建議使用真空采血管。



 3.5 其它標(biāo)本：如果病例有腹瀉癥狀，可在發(fā)病后采集糞便標(biāo)本；有胸水者可采集胸水標(biāo)本。



 4 標(biāo)本采集方法



 4.1 咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。



 4.2 鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。



 4.3 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。



 將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。



 4.4 咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口。漱口時讓患者頭部微后仰，發(fā)"噢"聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動。然后將咽漱液收集于50ml無菌的螺口塑料管中。無條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。



 4.5 深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于50ml含3ml采樣液的螺口塑料管中。



 4.6 呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集）。



 4.7 胸水:在B超定位下進行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無菌的塑料螺口管中。



 4.8 肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下,經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢標(biāo)本,置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。



 4.9 尸檢標(biāo)本：每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每種組織應(yīng)多部位取材，各部位應(yīng)取20～50g，淋巴結(jié)取2個。



 4.10 糞便標(biāo)本：采集5～10g糞便置于含5～10ml采樣液無菌螺口管中，嚴(yán)格密封。



 4.11 血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。



 注：常用的采樣液配方為：pH 7.4～7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。在采樣液中需加入抗菌素，可用青霉素（終濃度為100U/ml）、慶大霉素（終濃度為1mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為2μg/ml）。



 5 標(biāo)本包裝



 標(biāo)本采集后在生物安全Ⅱ級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝成一式三份（分裝標(biāo)本的生物安全柜不能用于提取核酸）。一份當(dāng)?shù)貦z測用，一份送中國疾病預(yù)防控制中心檢測，一份保存以備復(fù)核。



 5.1 所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的塑料管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。



 5.2 將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。



 5.3 標(biāo)本有關(guān)信息填寫"疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢單"見《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測和結(jié)果報告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號），用另一塑料袋密封。



 6 標(biāo)本保存



 用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進行檢測，24小時內(nèi)能檢測的標(biāo)本可置于4℃保存，24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存。如無－70℃保存條件，則于－20℃冰箱暫存。血清可在4℃存放3天、-20℃以下長期保存。標(biāo)本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４妗?


 7 標(biāo)本送檢



 7.1 上送標(biāo)本



 檢測結(jié)果陽性或可疑的原始標(biāo)本或分離物應(yīng)及時送中國疾病預(yù)防控制中心復(fù)核和進一步檢測；省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)實驗室檢測陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例的標(biāo)本送中國疾病預(yù)防控制中心進一步檢測。



 7.2 標(biāo)本運送的生物安全要求



 按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院424號令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號令）等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。



 7.3 標(biāo)本送檢的程序



 各?。▍^(qū)、市）需要向中國疾病預(yù)防控制中心送檢標(biāo)本時，應(yīng)事先與中國疾病預(yù)防控制中心疾病控制與應(yīng)急處理辦公室聯(lián)系。具體要求見《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測和結(jié)果報告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號）。



 8 實驗室生物安全



 從事人禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實驗技能，在檢測的過程中必須采取生物安全Ⅲ級防護。不同的標(biāo)本檢測生物安全級別要求如下。



 8.1 標(biāo)本的分裝和核酸提取在生物安全Ⅱ級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行，病毒培養(yǎng)物的核酸提取必須在生物安全Ⅲ級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行。



 8.2 標(biāo)本的抗原快速檢測在生物安全Ⅱ級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行。



 8.3 人禽流感病毒的分離、鑒定必須在生物安全Ⅲ級實驗室里進行。



 8.4 采用滅活抗原進行血凝抑制試驗檢測血清抗體時，要求在生物安全Ⅱ級實驗室內(nèi)操作。采用微量中和試驗進行血清抗體檢測必須在生物安全Ⅲ級實驗室操作。



 8.5 陽性標(biāo)本和分離物的保存及銷毀應(yīng)按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院第424號令）執(zhí)行。



 9 標(biāo)本的實驗室檢測



 9.1 核酸檢測：方法包括RT-PCR和Real-Time PCR，建議使用國家流感中心或世界衛(wèi)生組織推薦的引物和探針。



 9.2 抗原快速檢測方法包括ELISA法和金標(biāo)法，本方法僅具參考價值，不作為診斷依據(jù)。



 9.3 病毒分離及鑒定：采用SPF雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法。病毒的鑒定采用血凝抑制試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗或序列測定。



 9.4 血清學(xué)檢測：方法包括微量中和試驗、血凝抑制試驗、單擴溶血試驗。



 以上實驗室檢測方法詳見《全國流感/人感染高致病性禽流感監(jiān)測實施方案》。



 10 檢測結(jié)果的判斷和報告



 10.1 各檢測項目陽性報告



 10.1.1 H5基因核酸檢測：A型特異性引物能夠擴增出預(yù)期大小的產(chǎn)物，兩對H5亞型特異性引物都能夠擴增出預(yù)期大小的產(chǎn)物。



 10.1.2 抗原快速檢測：按照試劑盒說明書進行檢測，結(jié)果判斷為陽性。



 10.1.3 病毒分離及鑒定：分離出病毒，并經(jīng)鑒定為H5亞型或H5N1亞型。



 10.1.4 血清學(xué)檢測：雙份血清抗體滴度4倍或以上增高有診斷意義。



 10.2 各檢測項目陰性報告



 10.2.1 H5基因核酸檢測： 兩對H5亞型特異性引物均不能夠擴增出預(yù)期大小的產(chǎn)物。



 10.2.2 抗原快速檢測：按照試劑盒說明書進行檢測，結(jié)果判斷為陰性。



 10.2.3 病毒分離：培養(yǎng)物紅細(xì)胞凝集試驗陰性。



 10.2.4 血清學(xué)檢測：血清抗體滴度＜1:20為陰性。



 10.3 H5基因核酸檢測不一致



 兩對H5亞型特異性引物擴增出的產(chǎn)物檢測結(jié)果不一致時，則對陽性擴增產(chǎn)物進行測序，如果為H5N1病毒序列，則判斷為陽性。



 標(biāo)本檢測結(jié)果有關(guān)信息填寫"人感染高致病性禽流感標(biāo)本檢測結(jié)果反饋表"（具體見《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測和結(jié)果報告反饋工作流程》中疾控疾發(fā)[2005]526號）。



 11 實驗室檢測流程



 應(yīng)采集人禽流感檢測對象上呼吸道標(biāo)本和下呼吸道標(biāo)本進行禽流感病毒的核酸檢測和病毒分離，同時要采集病例的急性期和恢復(fù)期血清標(biāo)本進行H5N1亞型特異性抗體檢測。



 原則上，先由省級及以下疾病預(yù)防控制機構(gòu)進行初步檢測，陽性標(biāo)本送中國疾病預(yù)防控制中心復(fù)核；省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)實驗室檢測陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例標(biāo)本送中國疾病預(yù)防控制中心進一步檢測。



 省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)不具備檢測條件的，送中國疾病預(yù)防控制中心或鄰近具備相應(yīng)條件和資格認(rèn)證的省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)進行檢測。



 具體步驟見人感染高致病性禽流感標(biāo)本實驗室檢測流程圖。



 12 人禽流感實驗室檢測職責(zé)



 12.1 中國疾病預(yù)防控制中心職責(zé)



 12.1.1 對省級以及其它人禽流感檢測實驗室的檢測結(jié)果進行復(fù)核，并對上送的標(biāo)本做進一步檢測。



 12.1.2 對不具備禽流感病毒核酸檢測、病毒分離條件的省級上送的標(biāo)本進行檢測。



 12.1.3 對需做微量中和實驗的血清標(biāo)本進行微量中和試驗。



 12.1.4 對分離到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。



 12.1.5 及時向送檢標(biāo)本的機構(gòu)反饋檢測結(jié)果。



 12.1.6 對省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)實驗室人員進行實驗室技術(shù)和生物安全培訓(xùn)。



 12.1.7 對省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)實驗室提供技術(shù)和試劑支持并進行質(zhì)量控制。



 12.1.8 對省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)的實驗室檢測和生物安全工作進行督導(dǎo)。



 12.2 省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)職責(zé)



 12.2.1 對轄區(qū)內(nèi)人禽流感標(biāo)本的采集工作提供技術(shù)指導(dǎo)和物質(zhì)支持，必要時直接參與標(biāo)本的采集。



 12.2.2 按照生物安全要求，對采集到的標(biāo)本進行禽流感病毒的核酸檢測、血清學(xué)檢測和抗原檢測。獲得國家認(rèn)證的生物安全Ⅲ級實驗室才可開展病毒分離和微量中和試驗。



 12.2.3 按照生物安全要求妥善保存原始標(biāo)本或禽流感病毒株。



 12.2.4 符合上送條件的標(biāo)本或毒株按規(guī)定及時送中國疾病預(yù)防控制中心。



 12.2.5 及時向中國疾病預(yù)防控制中心上報人禽流感檢測的相關(guān)信息。



 12.2.6 及時向送檢標(biāo)本的機構(gòu)反饋檢測結(jié)果。



 12.2.7 根據(jù)疫情的發(fā)展和工作需要，向中國疾病預(yù)防控制中心申請指定轄區(qū)內(nèi)符合要求的國家級流感網(wǎng)絡(luò)實驗室開展相應(yīng)的人禽流感檢測工作。