• 【發(fā)布單位】國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【發(fā)布文號(hào)】國(guó)食藥監(jiān)注[2006]639號(hào)
• 【發(fā)布日期】2006-12-19
• 【生效日期】2006-12-19
• 【失效日期】--
• 【文件來(lái)源】國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【所屬類(lèi)別】政策參考

抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

(國(guó)食藥監(jiān)注[2006]639號(hào))





各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：



 為科學(xué)規(guī)范和指導(dǎo)藥物研究工作，保證藥物研究質(zhì)量，國(guó)家局組織制定了《抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等4個(gè)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，現(xiàn)予發(fā)布，請(qǐng)參照?qǐng)?zhí)行。



 附件：1．抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 2．手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 3．藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 4．細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則





 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局

 二○○六年十二月十九日





抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則



 一、 概述



 艾滋病的全稱(chēng)是“獲得性免疫缺陷綜合征”（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），它是由艾滋病病毒，即“人類(lèi)免疫缺陷病毒”（Human immunodeficiency virus，HIV）感染而導(dǎo)致的一種傳染性疾病。



 HIV在分類(lèi)學(xué)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科 (Retroviridae)、慢病毒屬 (Lentivirus)、靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒群 (Primate lentivirus group)。HIV分為二型：HIV-1和HIV-2。HIV-1為全球性流行，HIV-2主要流行于非洲少數(shù)國(guó)家。HIV-1較HIV-2 有更強(qiáng)的傳播和致病能力。由于目前的研究和治療經(jīng)驗(yàn)主要針對(duì)HIV-1，本指導(dǎo)原則主要涉及抗HIV-1的藥物。根據(jù)目前的認(rèn)識(shí)，HIV感染人體的靶細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的CD4+淋巴細(xì)胞，HIV的復(fù)制過(guò)程分為融合進(jìn)入、基因逆轉(zhuǎn)錄、基因整合、基因表達(dá)、病毒組裝及釋放等階段，抗HIV藥物研究的靶點(diǎn)主要針對(duì)上述幾個(gè)階段。



 本指導(dǎo)原則介紹了抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究的一般原則和主要內(nèi)容，還收載了抗HIV體內(nèi)外藥效學(xué)研究的一般方法等，供研發(fā)者參考。本指導(dǎo)原則主要涉及抗HIV的化學(xué)藥物，不包括中藥、生物制品、預(yù)防用藥和免疫調(diào)節(jié)劑等。



 本指導(dǎo)原則根據(jù)目前的認(rèn)知提出一些觀點(diǎn)和建議，旨在引導(dǎo)和推動(dòng)我國(guó)該類(lèi)藥物非臨床藥效學(xué)研究與評(píng)價(jià)的發(fā)展，并幫助研發(fā)者理解對(duì)臨床試驗(yàn)和/或臨床應(yīng)用有重要意義的數(shù)據(jù)，并非強(qiáng)制性要求。研發(fā)者可根據(jù)品種的具體特點(diǎn)和基礎(chǔ)研究情況，采用其他適宜的方法，但應(yīng)對(duì)采用的方法及其可靠性進(jìn)行說(shuō)明。



 二、 一般原則



 1、不同的抗HIV藥物作用機(jī)制不同，各有特點(diǎn)，可根據(jù)具體情況確定藥效學(xué)研究的內(nèi)容和順序。



 2、體外藥效學(xué)研究是闡明藥物具有抗HIV作用的基礎(chǔ)，是抗HIV藥物研究與評(píng)價(jià)的基本內(nèi)容。



 3、體內(nèi)藥效學(xué)研究對(duì)于進(jìn)一步說(shuō)明藥物的抗病毒作用、指導(dǎo)臨床試驗(yàn)有重要的參考價(jià)值。



 4、應(yīng)闡明藥物作用的主要靶點(diǎn)或病毒復(fù)制的階段，在此基礎(chǔ)上鼓勵(lì)進(jìn)行深入的作用機(jī)制研究。



 5、HIV具有高度的變異性，極易產(chǎn)生耐藥性。耐藥性研究有助于確定藥物的臨床適用范圍，鼓勵(lì)進(jìn)行該項(xiàng)研究。



 6、聯(lián)合用藥的體外藥效學(xué)研究對(duì)抗HIV藥物的臨床應(yīng)用配伍有一定的提示作用，可視具體情況考慮進(jìn)行此項(xiàng)研究。



 三、 主要研究?jī)?nèi)容



 1、 體外藥效學(xué)研究



 HIV可以在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)完成復(fù)制周期。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)藥物和/或其主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行可定量的體外抗病毒活性研究，以證明藥物的抗病毒效果，從而支持藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。體外抗病毒活性研究得到的劑量－效應(yīng)關(guān)系可以指導(dǎo)臨床試驗(yàn)劑量的選擇。由于HIV具有高度的變異性，體外抗病毒活性研究應(yīng)使用具有代表性的HIV毒株，特別是應(yīng)在原代人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）/HIV 臨床分離株培養(yǎng)系統(tǒng)中驗(yàn)證其抗HIV活性。



 體外藥效學(xué)試驗(yàn)需要首先確定一個(gè)沒(méi)有細(xì)胞毒性的藥物濃度，以便在細(xì)胞培養(yǎng)模型上區(qū)分藥物的抗病毒活性和藥物導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。應(yīng)在藥物濃度逐漸增加的情況下使用定量試驗(yàn)測(cè)定HIV復(fù)制的情況并與沒(méi)有藥物存在的情況進(jìn)行比較。治療指數(shù)（Therapeutic index, TI）是評(píng)價(jià)藥物體外抗HIV活性的最重要指標(biāo)。體外藥效學(xué)研究就是要在不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，測(cè)定藥物對(duì)HIV臨床分離株和實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株的抗病毒活性，分別計(jì)算出治療指數(shù)。具體試驗(yàn)方法可參考附錄中的相關(guān)內(nèi)容。



 藥物對(duì)HIV的有效抑制濃度應(yīng)與作用機(jī)理提示的數(shù)據(jù)一致。如果藥物抑制HIV復(fù)制的濃度低于作用機(jī)理研究所提示的濃度，提示可能存在其他作用靶點(diǎn)或機(jī)理。



 血清蛋白可以結(jié)合并屏蔽很多藥物，從而影響藥物的抗病毒活性。建議對(duì)血清蛋白結(jié)合率高的藥物進(jìn)行血清蛋白存在情況下的體外抗病毒活性研究。



 聯(lián)合用藥是目前臨床抗HIV治療的基本原則，主要目的是減少或延緩耐藥性毒株的產(chǎn)生。推薦與已經(jīng)上市的、具有不同作用機(jī)理、作用靶點(diǎn)和代謝特征的藥物進(jìn)行聯(lián)合抗病毒活性研究，這對(duì)于確定臨床聯(lián)合用藥方案具有一定的提示作用。



 2、 體內(nèi)藥效學(xué)研究



 目前尚缺乏理想的HIV感染動(dòng)物模型，但體內(nèi)藥效學(xué)研究對(duì)于進(jìn)一步說(shuō)明藥物的抗病毒作用、指導(dǎo)臨床試驗(yàn)仍有重要的參考價(jià)值。目前可供評(píng)價(jià)抗HIV藥物體內(nèi)有效性的動(dòng)物模型主要有二種：（1）猴艾滋病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染模型：SIV與HIV-1、HIV-2同屬慢病毒，可感染恒河猴、食蟹猴等。該模型既可考察藥物在體內(nèi)對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，又可觀察給藥后免疫功能重建的情況。（2）人淋巴組織重建的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型（Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu）：將人外周血淋巴和單核細(xì)胞或胸腺組織移植給SCID小鼠，然后感染HIV。



 盡管SIV感染模型與人艾滋病感染的病毒不同，其發(fā)病機(jī)理、臨床表現(xiàn)、病毒學(xué)及免疫學(xué)特征等也有差異，但SIV和HIV均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科，有較高的核苷酸序列同源性，具有相同的生活周期。SIV可選擇性地攻擊猴的CD4+細(xì)胞，猴感染SIV后出現(xiàn)與人艾滋病相似的發(fā)病過(guò)程和病理特征，是目前用于評(píng)價(jià)抗HIV藥物相對(duì)較好的動(dòng)物模型。SCID-hu小鼠模型也可用于抗HIV藥物的體內(nèi)藥效學(xué)研究，但需嚴(yán)格的飼養(yǎng)條件。



 動(dòng)物感染模型給藥后觀察的指標(biāo)包括：（1）病毒學(xué)指標(biāo)：病毒滴度、病毒抗原量以及病毒載量，耐藥性病毒的分離和鑒定等。（2）免疫學(xué)指標(biāo)：CD4+/ CD8+細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞功能等。（3）臨床指標(biāo)：癥狀、發(fā)病率和死亡率。（4）組織病理學(xué)指標(biāo)： 組織病理學(xué)變化。具體試驗(yàn)方法可參考附錄一中的相關(guān)內(nèi)容。



 3、作用機(jī)理研究



 由于目前尚缺乏理想的HIV感染動(dòng)物模型，體外抗病毒活性與人體內(nèi)實(shí)際情況的相關(guān)性又具有一定的局限性，作用機(jī)理研究對(duì)于進(jìn)一步闡明藥物的抗HIV作用、確定藥物的臨床治療定位和聯(lián)合用藥方案具有重要的意義，對(duì)預(yù)測(cè)藥物的毒性和闡明耐藥產(chǎn)生的機(jī)理也是有價(jià)值的。作用機(jī)理研究包括：（1）確定藥物特異性抑制病毒復(fù)制或病毒特定功能的能力。（2）確定藥物作用的靶點(diǎn)，例如：病毒融合進(jìn)入、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶等。



 除上述基本的機(jī)理研究以外，還可以采用生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等方法進(jìn)一步研究藥物對(duì)病毒的受體結(jié)合、酶活性、結(jié)合活性、蛋白剪切加工、病毒顆粒裝配等方面的作用；測(cè)定藥物的X－射線晶體結(jié)構(gòu)、分析作用靶點(diǎn)的耐藥性基因變異特征等。另外還應(yīng)通過(guò)對(duì)病毒和細(xì)胞/宿主蛋白靶點(diǎn)的研究證明藥物作用的特異性，特別是在細(xì)胞內(nèi)有病毒酶類(lèi)似物存在的情況下。例如，如果藥物作用于HIV多聚酶，相對(duì)于宿主細(xì)胞的DNA多聚酶（例如DNA多聚酶α, β, γ），藥物對(duì)HIV多聚酶的活性應(yīng)更為顯著。



 4、耐藥性研究



 鼓勵(lì)創(chuàng)新性抗HIV藥物進(jìn)行耐藥性研究。在研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注兩方面的問(wèn)題：一方面是藥物對(duì)HIV耐藥毒株是否有抗病毒活性，另一方面是藥物是否容易誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的基因型和表型耐藥性特性。



 四、 結(jié)語(yǔ)



 非臨床藥效學(xué)研究與評(píng)價(jià)是抗HIV藥物評(píng)價(jià)的重要組成部分，對(duì)于該類(lèi)藥物的臨床試驗(yàn)與臨床定位有重要的提示價(jià)值。在尚無(wú)理想的動(dòng)物模型的情況下，應(yīng)更加重視體外藥效學(xué)研究與評(píng)價(jià)。鼓勵(lì)進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究，盡可能提供有提示價(jià)值的相關(guān)研究資料。



 抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究應(yīng)按照藥物研發(fā)的客觀規(guī)律分階段持續(xù)地進(jìn)行，在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前提供必要的、足夠的有效性提示信息，在臨床試驗(yàn)和臨床應(yīng)用過(guò)程中還應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和需要進(jìn)行深入研究。



 由于抗HIV藥物研究與評(píng)價(jià)是一項(xiàng)不斷發(fā)展和探索的課題，本指導(dǎo)原則也將隨著研發(fā)和認(rèn)知水平的提高不斷修訂和完善。



 五、 參考文獻(xiàn)



 1、 FDA：Guidance for Industry：Antiviral Drug Development ― Conducting Virology Studies and Submitting the Data to the Agency（DRAFT GUIDANCE）. 2005.5



 2、 FDA：Guidance for Industry：Role of HIV Drug Resistance Testing in Antiretroviral Drug Development(DRAFT GUIDANCE）.2004.12



 3、 抗人免疫缺陷病毒（HIV-1）藥藥效學(xué)指導(dǎo)原則草案，蔣巖等，1999



 4、 中藥新藥治療艾滋病非臨床有效性研究與評(píng)價(jià)專(zhuān)題會(huì)紀(jì)要，藥審中心，2005.3



 六、 著者



 《抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組





 附錄一：

 抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究的一般方法



 HIV可用傳代人T淋巴細(xì)胞或原代人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)，T嗜性的病毒株可導(dǎo)致人T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變，如細(xì)胞融合、多核巨細(xì)胞等。M嗜性的病毒株一般不導(dǎo)致細(xì)胞病變，可通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清液的HIV p24抗原、病毒RNA或逆轉(zhuǎn)錄酶活性監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制的情況。體外藥效學(xué)試驗(yàn)一般應(yīng)重復(fù)三次。



 目前尚缺乏理想的HIV感染動(dòng)物模型，常采用替代模型或經(jīng)過(guò)改造的小動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)藥物的體內(nèi)抗HIV活性，如感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）或嵌合病毒（Simian/human immunodeficiency virus ，SHIV）的猴模型和感染HIV的人淋巴組織重建的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型(Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu)。



 本附錄收入了目前較成熟和常用的抗HIV體外、體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)方法，供研發(fā)者參考。今后可根據(jù)研究進(jìn)展情況進(jìn)一步修訂。



 一、體外藥效學(xué)試驗(yàn)



 1、病毒和細(xì)胞



 （1）病毒：應(yīng)盡可能選擇多種生物學(xué)表型和基因型的病毒株，包括HIV實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株和有代表性的HIV臨床分離株。在進(jìn)行抗HIV耐藥性毒株的藥效學(xué)研究時(shí)，應(yīng)選用耐藥性毒株；對(duì)于明確作用靶點(diǎn)的藥物，應(yīng)首先選擇對(duì)該作用靶點(diǎn)藥物耐藥的毒株。



 （2）細(xì)胞：應(yīng)盡可能選擇多種細(xì)胞。常用的有傳代人T淋巴細(xì)胞系（如CEM、MT4、MT2、C8166、H9等）、單核巨噬細(xì)胞系（如U937等）和活化的人原代外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。



 （3）病毒感染劑量的確定：測(cè)定HIV的感染劑量一般采用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上微量培養(yǎng)滴定的方法，通過(guò)觀察細(xì)胞病變或檢測(cè)病毒標(biāo)記物，如HIV p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶等，計(jì)算出病毒的感染性滴度（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，50% Tissue culture infectious dose， TCID50）。在不同的細(xì)胞系/病毒株培養(yǎng)系統(tǒng)，使用的病毒感染劑量不盡相同，一般選用100～1000TCID50。



 2、藥物的細(xì)胞毒性測(cè)定：將不同濃度的藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在特定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，用適宜的方法測(cè)定活細(xì)胞的比例，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的毒性（半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，Median toxic concentration，TC50）。



 3、抗HIV活性測(cè)定：



 （1）試驗(yàn)分組



 空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞。



 陽(yáng)性對(duì)照組：陽(yáng)性對(duì)照藥與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照藥一般選擇與受試藥物作用靶點(diǎn)相同的臨床有效藥物。



 陰性對(duì)照組：藥物溶媒與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng)。



 病毒對(duì)照組：病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng)。



 藥物對(duì)照組：受試藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)。



 試驗(yàn)組：受試藥物與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng)。



 （2）感染和給藥方法：一般采用藥物、病毒、細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)的方式，也可以根據(jù)藥物作用的靶點(diǎn)采取藥物先與HIV作用再加細(xì)胞、藥物先與細(xì)胞作用再加HIV或HIV先感染細(xì)胞再加藥物的感染和給藥方式。



 （3）監(jiān)測(cè)指標(biāo)和方法：



 細(xì)胞病變：在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，觀察有無(wú)HIV特征性的細(xì)胞病變（合胞體以及細(xì)胞融合）。



 HIV抗原：用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的HIV p24 抗原濃度。



 逆轉(zhuǎn)錄酶：用同位素?fù)饺牖蚱渌椒z測(cè)培養(yǎng)上清液的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。



 根據(jù)細(xì)胞病變觀察、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)的結(jié)果，計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制活性（半數(shù)抑制濃度，Median inhibition concentration, IC50）。



 4、藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)



 由于病毒的存活與復(fù)制依賴(lài)于宿主細(xì)胞，而抗病毒藥物本身有一定的細(xì)胞毒性，因此不能僅以細(xì)胞病變、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶活性作為藥效學(xué)評(píng)價(jià)的指標(biāo)，而應(yīng)以治療指數(shù)（TI）為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。一般認(rèn)為治療指數(shù)大于10的藥物可能具有體外抗HIV活性。



 5、藥物的聯(lián)合抗HIV活性測(cè)定



 將2～3種不同的藥物加入到同一實(shí)驗(yàn)體系中，按照前述的方法監(jiān)測(cè)病毒的抑制情況，判斷藥物對(duì)病毒的聯(lián)合作用。實(shí)驗(yàn)中除了設(shè)置一般體外藥效學(xué)研究需要的對(duì)照以外，還應(yīng)有各單藥對(duì)照。聯(lián)合抗HIV活性測(cè)定的數(shù)據(jù)分析方法比較復(fù)雜，需采用特定的模型和軟件。



 二、體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)



 1、SIV感染猴模型



 （1） 病毒：SIV毒株，靜脈注射或粘膜感染。



 （2） 動(dòng)物：恒河猴、食蟹猴等，體重5公斤左右，動(dòng)物數(shù)應(yīng)滿(mǎn)足評(píng)價(jià)的要求，一般每組4～6只。



 （3） 病毒感染劑量的測(cè)定：可采用兩種方法，一種方法是用保存的毒種在體外感染猴淋巴細(xì)胞，初步確定病毒的感染劑量。一般選擇三個(gè)劑量組，每組間10倍稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種兩只猴，感染后不同時(shí)間取血，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定病毒滴度，并定量檢測(cè)SIV RNA，以?xún)芍缓锞腥镜淖钚┝孔鳛樽钚「腥玖浚∕onkey infectious dose，MID100）。另一種方法是用感染猴的血漿接種猴，感染后每周取血測(cè)定SIV抗原和細(xì)胞培養(yǎng)病毒，計(jì)算半數(shù)感染量（Median infectious dose, ID50）。



 （4） SIV感染猴治療試驗(yàn)：



 急性感染治療試驗(yàn)：猴靜脈注射10～100ID50 或5MID100 的SIV，同時(shí)或4小時(shí)后口服或注射最大無(wú)毒劑量以下2倍遞減2個(gè)劑量的藥物，每天給藥，連續(xù)8周。每周取血，培養(yǎng)病毒，測(cè)定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，計(jì)算保護(hù)百分率，并與病毒對(duì)照組進(jìn)行比較。給藥前、停藥當(dāng)天和停藥后8周進(jìn)行淋巴結(jié)檢查，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變。另外，還要測(cè)定CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/ CD8+比值。



 慢性感染治療試驗(yàn)：猴靜脈注射10～100ID50或5～10MID100 的SIV，感染后60天左右開(kāi)始給藥，一般試驗(yàn)組在最大無(wú)毒劑量以下2倍遞減2個(gè)劑量。每天給藥，連續(xù)8周。于給藥前、給藥第8周、停藥當(dāng)天和停藥后8周取血，測(cè)定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，計(jì)算保護(hù)百分率，并與病毒對(duì)照組進(jìn)行比較。給藥前、停藥當(dāng)天、停藥后8周進(jìn)行淋巴結(jié)檢查，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變。另外，還要測(cè)定CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/ CD8+比值。



 2、HIV感染SCID-hu小鼠模型



 （1）動(dòng)物：SCID小鼠，4～8周齡，雌性，靜脈注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝臟組織。



 （2） HIV感染劑量測(cè)定：將HIV細(xì)胞培養(yǎng)上清液10倍連續(xù)稀釋5個(gè)濃度，靜脈注射或移植組織注射感染小鼠。1周后取小鼠的血液、脾、淋巴結(jié)和腹腔洗液，定量培養(yǎng)，測(cè)定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒載量，計(jì)算ID50。



 （3）藥物毒性測(cè)定：SCID-hu小鼠灌服或靜脈注射給藥，測(cè)定急性毒性和亞急性毒性，計(jì)算半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）和最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）。



 （4）HIV感染SCID-hu小鼠藥物治療試驗(yàn)：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID50 HIV，2～24小時(shí)后灌服或靜脈注射給藥。感染1周后，取血液、脾、淋巴結(jié)和腹腔洗液，定量培養(yǎng)，測(cè)定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒載量，計(jì)算抑制率和半數(shù)有效劑量（Median effective dose, ED50），并與病毒感染對(duì)照組進(jìn)行比較。





 附錄二：

 耐藥性研究的相關(guān)問(wèn)題



 考察藥物對(duì)HIV耐藥性毒株是否有抗病毒活性，至少應(yīng)該評(píng)價(jià)對(duì)相同作用靶點(diǎn)的耐藥性毒株的抗病毒活性，所選用的耐藥性毒株應(yīng)該經(jīng)過(guò)全面的鑒定。由于抗HIV藥物已經(jīng)有很多種，交叉耐藥性是臨床上的一個(gè)重要問(wèn)題，因此應(yīng)關(guān)注藥物對(duì)于相同作用靶點(diǎn)有耐藥性的病毒的抗病毒活性，及已上市藥物對(duì)受試藥物誘導(dǎo)的耐藥毒株的抗病毒活性。耐藥毒株的試驗(yàn)結(jié)果可提示藥物用于該類(lèi)耐藥株的臨床有效性。



 考察藥物是否容易導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的生物學(xué)特性，可在體外進(jìn)行耐藥毒株的誘導(dǎo)試驗(yàn)，以確定藥物是否容易導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的基因型和表型特征，并檢驗(yàn)交叉耐藥性。



 有些藥物的遺傳閾值比較低，病毒基因發(fā)生1～2個(gè)點(diǎn)突變就可產(chǎn)生耐藥性，而有些藥物的遺傳閾值比較高，需要多個(gè)基因位點(diǎn)的突變才能產(chǎn)生耐藥性?？刹捎脙煞N方法誘導(dǎo)藥物的耐藥毒株：（1）病毒在固定的藥物濃度下連續(xù)傳代，可使用多個(gè)不同藥物濃度的培養(yǎng)系統(tǒng)，這種方法對(duì)于遺傳閾值低的藥物比較有效；（2）病毒在逐漸增加藥物濃度的情況下連續(xù)傳代培養(yǎng)，藥物濃度從IC50值的一半起始，監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制的情況并誘導(dǎo)出耐藥毒株。



 用基因型和表型方法對(duì)誘導(dǎo)出的耐藥毒株進(jìn)行鑒定。基因型分析可以確定哪些基因突變導(dǎo)致HIV對(duì)藥物的敏感性下降，主要方法是對(duì)HIV基因組中藥物作用的靶基因進(jìn)行核酸序列測(cè)定，并與野生毒株的靶基因序列進(jìn)行比較。對(duì)傳代過(guò)程中不同代次的毒株進(jìn)行序列測(cè)定可確定多個(gè)突變出現(xiàn)的先后順序。表型耐藥性分析能夠確定突變的病毒是否對(duì)藥物的敏感性下降以及下降的程度。耐藥性相關(guān)基因突變的確定有助于使用重組病毒系統(tǒng)評(píng)估這些突變導(dǎo)致的表型耐藥性，也就是使用定點(diǎn)誘變系統(tǒng)或PCR方法擴(kuò)增病毒基因組相應(yīng)的部分引入這些特定的突變，以便檢測(cè)重組病毒在體外對(duì)藥物的敏感性；也可以采用在含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，通過(guò)測(cè)定HIV抗原、HIV RNA、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)胞毒性或報(bào)告基因的表達(dá)等確定IC50值并與參考毒株的IC50進(jìn)行比較，以IC50增加的倍數(shù)作為衡量表型耐藥性的指標(biāo)。





 附錄三：

 名詞解釋



 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50%Tissue culture infectious dose ,TCID50）：是使50%細(xì)胞感染的病毒稀釋度。



 半數(shù)有效量（Median effective dose）：是能引起50%陽(yáng)性反應(yīng)或50%最大效應(yīng)的濃度或劑量，分別用半數(shù)有效濃度（EC50）、半數(shù)抑制濃度（IC50）或半數(shù)有效劑量（ED50）表示。如果效應(yīng)指標(biāo)為毒性或死亡，則可改為半數(shù)毒性濃度（TC50）、半數(shù)毒性劑量（TD50）或半數(shù)致死濃度（LC50）、半數(shù)致死劑量（LD50）表示。



 治療指數(shù)（Therapeutic index, TI）：藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的效力與抑制病毒復(fù)制的效力的比值（50%細(xì)胞毒性濃度/50%有效抑制濃度，TC50/IC50），



 半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗(yàn)條件下引起50%動(dòng)物死亡的劑量。



 最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）：不引起受試動(dòng)物死亡的最高劑量。